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細胞被劃分為不同的隔間，以調(diào)節(jié)信息流并聚集生物分子。在真核細胞中，有兩個主要的區(qū)室：細胞質(zhì)和細胞核。最近的研究進一步強調(diào)了蛋白質(zhì)空間定位的重要性，蛋白質(zhì)在細胞中的異常定位是各種疾病發(fā)展的關(guān)鍵因素。為了更好地理解并潛在地操縱蛋白質(zhì)定位以治療各種相關(guān)疾病，作者設(shè)計了一種雙功能分子來達到上述目的。下載化學加APP到你手機，更加方便，更多收獲。

首先，作者假設(shè)化學誘導靶蛋白與組成性核蛋白的接近將實現(xiàn)靶蛋白核定位（圖1a）。為了證實這一點，作者選取了一種豐富的、核定位的且具有經(jīng)過充分驗證的、可以功能化的小分子結(jié)合劑的蛋白質(zhì)——BET溴結(jié)構(gòu)域蛋白，并以JQ1為其配體，合成了由JQ1和AP1867組成的雙功能分子（NICE-01，圖1b），AP1867用來結(jié)合FKBP^F36V。隨后作者發(fā)現(xiàn)，在FKBP^F36V-mEGFP和mCherry-BRD4共轉(zhuǎn)染的細胞中添加NICE-01（200 nM，40分鐘；圖1c）后FKBP^F36V-EGFP快速易位到細胞核。然后，作者假設(shè)內(nèi)源性含BET的蛋白質(zhì)可以用作核導入的“載體”。在穩(wěn)定表達FKBP^F36V-mEGFP的細胞中，NICE-01（250 nM，3小時）可以在細胞核中富集mEGFP（圖1d和圖S1）。

雙功能化合物的一個決定性特征是觀察到“鉤效應(yīng)”（hook effect）。在缺乏外源mCherry-BRD4的細胞中，10 μM NICE-01不能誘導FKBP^F36V-mEGFP的入核。然而，在該劑量下轉(zhuǎn)染mCherry-BRD4能夠讓入核發(fā)生（圖1f）。這與理論一致，即在給定濃度的化合物下，三元復(fù)合物形成的減少可以通過進一步添加蛋白質(zhì)來緩解。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

隨后，作者還發(fā)現(xiàn)，三元復(fù)合物組分的化學計量是影響核導入的關(guān)鍵。當依賴于內(nèi)源性BET蛋白時，F(xiàn)KBP^F36V-mEGFP的入核程度較弱，缺乏mEGFP胞質(zhì)排斥（圖1g和圖S1），這可能與通過瞬時轉(zhuǎn)染獲得的蛋白水平異常高于內(nèi)源性蛋白水平有關(guān)。這一結(jié)果表明，核導入的細胞特異性一部分表現(xiàn)在核定位載體表達的數(shù)量差異。另外，配體親和力似乎也很重要。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

接下來，作者假設(shè)可以使用化合物處理后觀察到的FKBP^F36V-mEGFP濃度的變化來計算蛋白質(zhì)在核膜中擴散的動力學參數(shù)并構(gòu)建了一個核導入步驟的模型（圖S3）。對單個細胞的胞質(zhì)FKBP^F36V-mEGFP的部分進行定量。在短的初始期后，核輸入相對于細胞質(zhì)中的FKBP^F36V-mEGFP部分顯示出一級動力學（圖S3）。這個估算的結(jié)果接近HeLa細胞中麥芽糖結(jié)合蛋白的被動輸入速率。這些數(shù)據(jù)表明，結(jié)合BRD4的雙功能化合物誘導靶蛋白封閉在核內(nèi)。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

先前的研究表明，將細胞質(zhì)突變體NPM1c重新定位到細胞核中可以減少HOX基因的表達，從而誘導白血病分化和細胞死亡。用FKBP^F36V-mEGFP-NPM1c和mCherry-BRD4共轉(zhuǎn)染的細胞在用NICE-01處理后幾分鐘內(nèi)顯示FKBP^F36V-mEGFP-NPM1c快速重新定位到細胞核中（圖2a）。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

有趣的是，并不是所有的細胞對化合物處理都表現(xiàn)出一致的反應(yīng)。作者分析了導入程度不同的細胞的FKBP^F36V-EGFP-NPM1c與mCherry-BRD4的比率（圖2c）。數(shù)據(jù)表明，三元復(fù)合物組分的化學計量可以影響對雙功能化合物的表型反應(yīng)，并可以解釋觀察到的單細胞表型異質(zhì)性。

作者用雙功能化合物處理NPM1c和BRD4共轉(zhuǎn)染的U2OS細胞，然后每1分鐘進行一次高分辨率顯微鏡成像，證實了胞質(zhì)和核仁凝聚物中的NPM1c移動到BRD4凝聚物中（圖2d）。作者還注意到FKBP^F36V-mEGFP摻入核凝聚物中，即使它們依賴于內(nèi)源性含BET的蛋白質(zhì)入核（圖1e）。這些發(fā)現(xiàn)表明，鄰近誘導分子可以針對性地改變凝聚物的組成。

隨后，作者假設(shè)p53能夠作為核載體來誘導NPM1c在細胞核中的定位。用FKBP^F36V-mEGFP-NPM1c和Halo-p53^R273H-mCherry轉(zhuǎn)染293T細胞，令人驚訝的是， Halo-p53^R273H-mCherri僅在與FKBP^F36V-mEGFP-NPM1c共轉(zhuǎn)染時定位于細胞質(zhì)（圖3a）。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

細胞溶質(zhì)p53與DNA在物理上分離，其大部分腫瘤抑制活性可能受到抑制。因此，NPM1c介導的p53出核可能對突變的致癌性至關(guān)重要，這一點尚不清楚。作者發(fā)現(xiàn)NICE-01并不能在表達BRD4 Flag和FKBP^F36V-mEGFP-NPM1c的293T細胞中重新定位Halo-p53^R273H-mCherry，這表明p53并不總是以一定的共定位方式與NPM1c在物理上連接（圖3e）。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

最后，作者認為NICE-01可以誘導轉(zhuǎn)錄因子IRF1的核導入和轉(zhuǎn)錄激活。在不存在雙功能化合物的情況下，F(xiàn)KBP^F36V-mEGFP-IRF1-NES從細胞核中移出（圖S4）。當用NICE-01（250 nM）處理時，在共表達mCherry-BRD4和FKBP^F36V-mEGFP-IRF1-NES的細胞中可以觀察到mEGFP快速導入（<20分鐘）。然而，在沒有外源性BRD4的情況下，作者無法通過光學顯微鏡檢測到FKBP^F36V-mEGFP-IRF1-NES的輸入，這可能是因為與BRD4相比，F(xiàn)KBP^F36V-mEGFP-IRF1-NES大大過量（圖S4）。在用NICE-01（250 nM）處理并表達FKBP^F36V-mEGFP-IRF1-NES的293T細胞中，RNA-seq顯著上調(diào)IRF1-ChIP-seq靶點（圖4a）。通過基因集富集分析，作者還觀察到標志性干擾素反應(yīng)基因集的顯著陽性富集（圖4b）。這些結(jié)果表明化學誘導BRD4定位于胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子足以誘導其靶基因的表達。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)