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光酶催化劑可以實現高立體選擇性的自由基反應，主要是由于轉化可以發生在可調節的酶活性位點內。當將黃素蛋白（flavoproteins）用于非天然光酶反應時，通常使用還原機理來引發自由基。而通過氧化機理來實現自由基的形成將會豐富自由基前體的官能團類別，如胺和羧酸等。然而，激發態黃素在許多蛋白質中是短壽命的，因為它會被蛋白質骨架快速淬滅。最近，美國普林斯頓大學Todd K. Hyster課題組報道了在黃素依賴的“烯”還原酶中添加外源的Ru(bpy)₃²⁺輔助因子，使氨基酸與乙烯基吡啶的氧化還原-中性脫羧偶聯具有高產率和高對映選擇性。此外，作者還發現了立體互補的酶來分別實現產物兩個對映體的合成（Fig. 1）。下載化學加APP到你手機，更加方便，更多收獲。

（圖片來源：Nat. Catal.）

首先，作者選擇N-苯基甘氨酸1a和烯基吡啶2a作為模板底物，對反應進行了探索（Fig. 2）。通過對一系列酶的篩選，作者發現當使用1a (10 μmol, 1 equiv.), 2a (35 μmol, 3.5 equiv.), 純凈的 OYE3 (1 mol%), Ru(bpy)₃Cl₂·6H₂O (1 mol%), NADP⁺ (1 mol%), GDH-105 (0.3 mg ml^?1) , 葡萄糖 (1.5 equiv.), Tris buffer (900 μl,100 mM, pH 7.6)和 DMSO (150 μl, 14% v/v) 作共溶劑，在藍光照射下室溫反應14小時可以以90%的產率，93:7的er得到脫羧烷基化產物(S)-3（entry 2）。控制實驗證實了實現此轉化的重要因素（entries 5-10）：當移除OYE3時，偶聯反應是可以發生的，以71%的產率得到外消旋體產物。由此表明光催化劑可以在沒有蛋白質存在的情況下促進自由基的引發和終止。相反，當移除光催化劑時，產率僅為2%，但er為97:3，由此表明該蛋白負責自由基的終止。當去除輔助因子翻轉混合物（cofactor turnover mix）時，作者觀察到產物的對映體選擇性降低(65:35 er)，可能是由于是FMN_sq實現了自由基的終止，而非FMN_hq。由于FMN_sq的N5-H鍵(59.5 kcal mol^?1)弱于FMN_hq (79.3 kcal mol^?1)，因此自由基終止應該具有更早的過渡態，從而降低了對映選擇性。由此看來，必須添加輔助因子再生系統，以確保反應在對苯二酚氧化狀態下被FMN引發。此外，為了避免外消旋的背景反應發生，需要精確控制Ru(bpy)₃Cl₂的量(與OYE3的比例為1:1)。

（圖片來源：Nat. Catal.）

接下來，作者考察了此轉化是如何在存在明顯的外消旋背景反應下高對映選擇性實現轉化的（Fig. 3）。作者最初的假設是ERED通過質子耦合電子轉移（proton-coupled electron transfer）機理實現底物氧化。如果是這樣的話，此反應會因為蛋白質的存在而加速，因為第一個不可逆的步驟是氧化脫羧。驚訝的是，在存在和不存在蛋白質的情況下，作者觀察到了幾乎相同的速率，這表明蛋白質并沒有加速羧酸的氧化。Stern-Volmer淬滅研究進一步支持了這一觀點，表明N-苯基甘氨酸淬滅Ru(II)*的速率常數為K_q = 41.4 M^?1 s^?1（Fig. 3a）。當還原的OYE3加入到相同的淬滅實驗時，作者觀察到淬滅常數的變化可以忽略不計，由此證實該蛋白質不會加速底物的氧化。

在排除了底物通過酶活化氧化的可能性后，作者認為自由基的形成和C-C鍵的形成發生在溶液中，從而形成一個持久的或動態穩定的自由基，選擇性的在蛋白質活性位點終止。接下來，作者通過DFT計算得出通過自由基二聚化形成的C-C鍵的鍵能為35.4 kcal mol^?1（Fig. 3b）。雖然它比典型的C-C鍵(80 kcal mol^?1)要弱，但由于它較強且不能可逆地形成，因此這表明自由基的生成和C-C鍵的形成不在溶液中發生。基于催化劑和蛋白質之間的關聯，作者認為自由基的形成發生在蛋白質的活性位點。通過熒光淬滅實驗（fluorescence-quenching experiments），作者得出酶和輔助因子之間有很強的聯系，這為在蛋白質附近形成自由基提供了一種機理（Fig. 3c）。基于光催化劑和酶之間的聯系，作者提出了可能的反應機理（Fig. 3e）：首先，利用輔助因子周轉混合物，將ERED從FMN_ox(黃素醌，flavin quinone)還原為FMN_hq。接下來，N-苯基甘氨酸和乙烯基吡啶結合到蛋白質活性位點。Ru(bpy)₃²⁺通過激發產生激發態，使羧酸氧化生成α-氨基自由基和Ru(bpy)₃¹⁺。此α-氨基自由基可以和烯基吡啶反應得到芐基自由基，并通過氫原子轉移（HAT，hydrogen atom transfer）終止自由基（Fig. 3d）。而得到的FMN_sq可以通過電子轉移和質子化來氧化Ru(bpy)₃¹⁺，并再生FMN_hq和Ru(bpy)₃²⁺。

（圖片來源：Nat. Catal.）

緊接著，作者對α-雜環烯烴與氨基酸的對映選擇性脫羧烷基化反應的底物范圍進行了探索（Fig. 4）。實驗結果表明，在吡啶環上具有鄰位、間位和對位取代基的各種一系列烯烴均可兼容，以19-90%的產率，良好的對映選擇性實現交叉偶聯產物3, 7-17的合成。除了2-吡啶之外，該體系還可以兼容嘧啶(18)，吡嗪(19和20)，噻唑(25和26)，3-吡啶(21)和4-吡啶(22)，以良好的收率和優異的立體選擇性（分別高達99:1 er和2:98 er）得到所需產物。此外，一系列不同取代的氨基酸同樣具有良好的兼容性，以16-81%的產率，良好的對映選擇性得到產物33-43。值得注意的是，此轉化可以放大至1.0 mmol規模，在不降低對映選擇性的情況下以70%的產率得到產物(S)-3。

（圖片來源：Nat. Catal.）

最后，作者探索了此轉化的應用性（Fig. 5）。利用8-氨基喹啉44作為起始原料，通過N-烷基化、皂化、光酶催化的脫羧烷基化等三步就可高效實現抗人巨細胞病毒（HCMV）化合物47的合成（41%; 91:9 er）。此外，作者利用活化烯烴48與1a通過脫羧烷基化以及隨后與EtONa反應可以得到γ-內酰胺50（30%; 78:22 er）。

（圖片來源：Nat. Catal.）