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Sci. Adv.：空間位阻誘導的扭曲分子內電荷轉移策略實現熒光的“開-關”
來源：化學加原創 2024-03-05
導讀：近日，慶應義塾大學Kenjiro Hanaoka和東京大學Yasuteru Urano等人合作，在基于空間位阻誘導的扭曲分子電荷轉移的熒光探針的設計與應用方面取得新進展，相關研究成果以“A general fluorescence off/on strategy for fluorogenic probes: Steric repulsion-induced twisted intramolecular charge transfer (sr-TICT)”為題發表在Sci. Adv.上。基于時間相關密度泛函（TD-DFT）的理論計算數據，本文采用空間位阻誘導的扭曲分子內電荷轉移（sr-TICT）機制設計合成了一系列具有熒光“開-關”性質的羅丹明染料。作者將所制備的具有CYP3A4活性的探針2-Me PeER用于熒光激活細胞分類（fluorescence-activated cell sorting，FACS）技術當中。該研究為sr-TICT型熒光探針的設計提供了通用的策略。文章鏈接DOI: 10.1126/sciadv.adi8847。
熒光探針的優點在于其高靈敏度、高選擇性和非侵入性，因而可以實現快速、準確地檢測。大多數具有熒光“開-關”性質的分子設計是基于光誘導電子轉移（PeT）、F?rster共振能量轉移（FRET）和分子內螺旋環化，尚不能滿足熒光探針的應用需求。羅丹明是一種具有明亮發射、高光學穩定性和水溶性的染料，作者研究了N-烷基化羅丹明染料的sr-TICT過程以探明熒光“開-關”的響應機制。在羅丹明的TICT過程中，在光激發后電荷轉移主要發生在氨基（電子給體）到氧雜蒽骨架（電子受體）之間，同時伴隨著氧雜蒽骨架與N原子間（Caryl-N）單鍵的扭轉（Fig. 1A和B）。盡管N-烷基化羅丹明染料由于TCIT過程的存在而熒光淬滅，但是該染料的種類較少且Caryl-N鍵易受限制。因此，N-烷基化羅丹明染料的發光亮度適中。下載化學加APP到你手機，收獲更多商業合作機會。本文中，作者首先利用理論計算數據分析了羅丹明染料中的TICT過程，進而設計合成了一系列改進的羅丹明染料。通過結構修飾引入分子內扭轉基團，加速了染料分子的TICT過程從而使熒光被淬滅。最后，作者制備了具有CYP3A4活性的熒光探針并通過熒光激活細胞分類技術得到了均勻的、高功能性的人類誘導的多能干細胞衍生的肝細胞和腸上皮細胞。如Fig. 1C和D所示，激發態的羅丹明染料在j = 50° ~ 60°時具有旋轉勢壘。Azetidinyl-羅丹明染料的旋轉勢壘要比四甲基羅丹明（TMR）要高，因此前者的TICT態相比于LE態更不穩定。以上結果表明Azetidinyl-羅丹明染料中較高的勢壘和TICT態的不穩定性抑制了TICT過程，進而使染料的亮度增強。基于理論計算數據，作者通過增強TICT的途徑發展了非熒光羅丹明染料。作者認為降低LE態到TICT態的旋轉勢壘同時穩定TICT態可以加速TICT態的形成。因此，假設在羅丹明染料中的二烷基胺基的鄰位引入“體積大”的基團可以使分子的空間位阻增大，打破分子的平面性，加速TICT態的形成（Fig. 1E）。為了驗證該策略的有效性，作者設計了探針2-Me TMR并計算了Caryl-N鍵的旋轉角度對總能量的依賴關系（Fig. 1F）。
Figure 1. 羅丹明染料TICT過程的理論計算和基于TICT機制的羅丹明非熒光染料的分子設計
接下來，作者設計合成了2-Me TMR染料并分析其光學穩定性。盡管2-Me TMR與TMR染料的吸收光譜相似（Fig. 2A和B），但是前者的熒光量子產率顯著降低。如Fig. 2C所示，隨著溶液體系粘度的增加，分子的熒光量子產率也隨之增加。此外，由于溶劑的極性會影響分子的TICT過程，2-Me TMR在低極性溶劑中具有更高的熒光量子產率。以上結果表明由于空間位阻基團的引入，染料2-Me TMR表現出TICT特征。為了驗證位阻基團的“尺寸”對TICT過程的影響，作者合成了含F和Cl原子的羅丹明染料衍生物。由于F原子的“尺寸”較小，sr-TICT過程的發生相對較容易，從而展現出較高的熒光量子產率（Fig. 2D和E）。同時，2-F TMR和2-Cl TMR染料的旋轉勢壘要比TMR小，TICT態相比于LE態也更加穩定（Fig. 2F）。
Figure 2. 基于sr-TICT機制的羅丹明非熒光染料的分子設計（圖片來源：Sci. Adv.）
為了研究雜蒽骨架上氨基取代基對sr-TICT過程的影響，作者合成了2-Me TMR 和2-Cl TMR（Fig. 3A和B）。N-去甲基衍生物的熒光量子產率相比于未取代染料的熒光量子產率要高。以上結果表明sr-TICT的熒光淬滅效率可以通過調控氨基取代基實現。理論計算和熒光量子產率-旋轉勢壘數據均證明羅丹明染料的TICT態與旋轉勢能Ea和LE態的ΔH有關（Fig. 3C和D）。
Figure 3. 氨基取代基對sr-TICT過程的影響以及基于sr-TICT機制的羅丹明染料的TD-DFT計算
作者利用染料對細胞色素P450 3A4（CYP3A4）的N-脫烷基化過程得到了具有熒光“開-關”性質的探針（Fig. 4A）。在加入CYP3A4后，2-Me HER顯示出特異性的熒光增強現象（Fig. 4B）。此外，作者發現增加烷基的鏈長還能夠提升染料對CYP3A4的反應活性。最后，2-Me PeER在PBS緩沖液中的低蛋白含量條件下對CYP3A4具有很高的反應活性和較低的熒光量子產率（Fig. 4C和D）。同時，2-Me PeER對CYP3A4也表現出明顯的熒光增強性質和高選擇性（Fig. 4E）。此外，2-Me PeER還展示出對人肝微粒體（HLM）的熒光增強特征（Fig. 4F）。
Figure 4. CYP3A4和2-Me PeER活性熒光探針的設計及體外實驗（圖片來源：Sci. Adv.）
在細胞實驗中，2-Me PeER在活細胞中可以對CYP3A4進行熒光成像（Fig. 5A-C）。同時，2-Me PeER 還能夠對HepaRG細胞進行明亮的熒光成像（Fig. 5D和F）。2-Me PeER主要被類肝細胞代謝并保留在細胞內，該性質有利于使2-Me PeER能夠在復雜的培養條件下評價細胞的CYP3A4的活性，有望被用于熒光激活細胞分類術中。
Figure 5. 2-Me PeER活性熒光探針的活細胞成像
最后，利用熒光激活細胞分類技術，作者還成功驗證了2-Me PeER可對多能干細胞來源的肝樣細胞和腸道上皮細胞進行分類篩選（Fig. 6）。
Figure 6. 2-Me PeER活性熒光探針的細胞實驗
（圖片來源：Sci. Adv.）
慶應義塾大學Kenjiro Hanaoka和東京大學Yasuteru Urano等人通過理論計算數據分析了羅丹明染料中的TICT過程，從而利用空間位阻策略加速了TICT過程，實現了對熒光強度的調控。為了驗證策略的有效性，作者驗證了2-Me PeER探針在體外實驗中可以高靈敏度地檢測CYP3A4，表現出在藥物篩選方面的巨大應用潛力。文獻詳情：
Kenjiro Hanaoka*, Takayuki Ikeno, Shimpei Iwaki, Sayaka Deguchi, Kazuo Takayama, Hiroyuki Mizuguchi, Fumiya Tao, Nobuhiko Kojima, Hisashi Ohno, Eita Sasaki, Toru Komatsu, Tasuku Ueno, Kazuya Maeda, Hiroyuki Kusuhara, Yasuteru Urano*. A general fluorescence off/on strategy for fluorogenic probes: Steric repulsion-induced twisted intramolecular charge transfer (sr-TICT). Sci. Adv.2024，https://doi.org/10.1126/sciadv.adi8847
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