α-酮醛類化合物在生命體內由糖代謝產生，能夠與蛋白質反應生成晚期糖基化終末產物（圖2A和2B）。鄰位二羰基結構給α-酮醛帶來獨特的反應性，使其在生理條件下無需酶催化即可與各種含N基團發生反應。α-酮醛和含N官能團的縮合可能會發生不尋常的重排反應（圖1C），生成兩分子交聯的產物GOLD和MOLD或賴氨素羧基化產物CML和CEL。此外，該過程還能夠生成精氨酸修飾產物hydroimidazolone和argpyrimidine，或賴氨素與精氨酸交聯產物MODIC（圖2B）。迄今為止，α-酮醛類化合物在生物醫藥中僅成功應用于對蛋白質中精氨酸殘基的標記（圖2A）。相比之下，α-酮醛與胺的反應卻報道的很少。在Baynes課題組的仿生研究中，他們發現GO可以和簡單的烷基胺在生理條件下生成中等收率的GOLD產物（圖2D）。然而，該策略同時也會生成大量的N烷基化副產物。隨后，Esposito課題組報道了在AcOH和H2O的混合溶劑中額外引入甲醛的方法，可以高效地得到GOLD產物（圖2D）。值得注意的是，這兩種方法都只在簡單的烷基胺底物上進行了驗證，對于精氨酸潛在的干擾問題仍未解決。近年來，南開大學陳弓教授課題組報道了多種基于甲醛的高效且選擇性優異的復雜多肽修飾方法（Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 6646；J. Am. Chem. Soc. 2022, 144, 10080；J. Am. Chem. Soc. 2024, 146, 5952），其中六氟異丙醇溶劑能顯著促進反應的進行。同時受到蛋白質糖基化中MODIC連接體的啟發，作者嘗試將乙二醛化合物在六氟異丙醇中用于多肽的環化修飾。作者首先嘗試了三肽NA-Arg-Gly-Lys-NH2（NA：2-萘甲?；?，用于增強多肽LCMS分析的UV檢測）與乙二醛在六氟異丙醇中進行反應，發現該反應并沒有生成預想的Arg-Lys交聯的MODIC產物，而是主要生成了GOLD產物。隨后，作者嘗試用含有兩個Lys的模板肽NA-Lys-Gly-Ala-Lys-OH 3通過乙二醛進行分子內的關環。作者發現當使用3當量的GO和3當量的DIPEA在10 m濃度的六氟異丙醇中反應30 min即可定量轉化成GOLD環肽產物。隨后，作者對多肽底物的適用性進行考察（圖3）。作者發現，除半胱氨酸外，該反應對其余天然氨基酸均具有良好的兼容性。含有Tyr（7）、His（8）、Trp（13）、Thr（9）、Ser（9）、Asp（10）、Asn（20）和Met（17）的多肽底物對該反應均耐受。作者發現巰基底物NA-Cys-OH 25能夠和GO生成硫代半縮醛產物26及其他一些復雜產物。精氨酸底物NA-Arg-OH 27，能夠在標準條件下與乙二醛反應生成小于3%的28a和28b的混合物。由此可見，Arg在六氟異丙醇中的反應活性明顯低于Lys，特別是與兩個Lys的交聯反應相比。對于含有精氨酸的多肽底物10和14，均能高選擇性的得到GOLD產物。同時作者也發現，如果加入大過量的GO或者延長反應時間，也會監測到精氨酸修飾的產物11。兩個賴氨酸的距離對于環化效率沒有顯著影響。此外，該反應對于多種具有生物活性多肽也具有良好的反應效果，如環肽抗生素gramicidin S和N-Ac GLP-1均可以高效轉化成相應的環化產物。除了對兩分子賴氨酸交聯，該策略同樣適用于N端與賴氨酸的環化，如23和24。該反應對烷基和芳基取代的α-酮醛衍生物也具有良好的反應效果，能夠生成各種官能化咪唑交聯的環肽產物（圖4）。值得注意的是，取代的乙二醛參與反應會導致生成的咪唑結構含有一對異構體。其中，各種取代的α-酮醛可以通過SeO2氧化的Riley反應輕松制備。α-酮醛上烷基取代基可能會降低多肽環化的效率，因此需要4當量的乙二醛底物在40 oC下反應4小時才能較好的轉化。各種鏈狀烷基及環狀烷基取代的乙二醛底物均能與模板肽3反應得到相應的環化產物（4a-4e）。對于芳基取代的α-酮醛底物需要升溫至60 oC反應12小時才能實現定量轉化。如底物4f-4p所示，該反應對苯環上的各種取代基均具有良好的耐受性。此外，該反應還可以在咪唑結構上引入炔基（4r），呋喃基（4q），萘基（4s），芘基（4v）和四苯乙烯熒光基團（4t），進一步豐富環肽骨架的多樣性。值得注意的是，芳基乙二醛可能會發生自身反應，生成不同數量的未識別副產物。然而，這些副產物不會影響環化的進程，并且可以通過乙醚后處理輕松的除去。如圖5A所示，咪唑骨架的交聯反應還可以在固相上高效進行。作者首先用Rink樹脂通過固相合成方法制備了線性序列。其中，參與交聯的賴氨酸的殘基用Dde基團正交保護。隨后，Dde保護基可以在5%的水合肼的DMF溶液中選擇性脫除，并將脫去Dde的樹脂在六氟異丙醇中與不同α-酮醛化合物進行環化反應。最后，用TFA/H2O的混合液將多肽從樹脂上裂解下來，并通過制備級HPLC純化，得到相應的環肽產物。Anoplin是一種具有多種藥理活性的短型兩親性α-螺旋毒液肽。最近，有課題組報道Anoplin可以通過金屬催化的烯烴復分解反應進行裝訂，來產生對癌細胞具有溶瘤活性的環肽。作者通過兩輪概念驗證研究，將α-酮醛介導的固相裝訂反應用于構效關系探索以提高生物活性（圖5B）。在第一輪構效關系研究中，作者通過變換兩個賴氨酸的位置和GO進行反應，得到相應的GOLD產物。隨后，作者通過對小鼠乳腺癌細胞4T1進行細胞毒性實驗，篩選出環肽Ano-D和Ano-E具有較好的癌細胞殺傷效果。在第二輪實驗中，作者基于Ano-D和Ano-E的序列，與修飾的α-酮醛進行反應，得到各種取代的咪唑環肽產物。作者通過細胞毒性實驗，篩選出效果更好的環肽產物，分別是正辛基取代的Ano-Dc（IC50 = 6.6 μM）和對三氟甲基苯基取代的Ano-Eh（IC50 = 6.8 μM）作者基于前期HFIP促進多肽修飾的探索，提出了針對HFIP促進的條件下的新型MOLD反應機制（圖6）。MO首先與烷基胺縮合成可逆的雙亞胺中間體I。另一分子MO與雙亞胺I反應生成中間體II，隨后與體系中的H2O反應得到水合物III。中間體III能夠在HFIP的作用下，發生C-C鍵的斷裂，脫去CH3COOH得到中間體IV。最后，中間體IV發生分子內進攻后脫水，得到最終的咪唑骨架產物。其中，中間體III的脫酰化是該反應的關鍵。作者也在最近的研究中（J. Am. Chem. Soc. 2024, 146, 5952）發現HFIP能夠形成聚集體，通過H鍵介導的大環過渡態進行分子間的氫化物轉移。在該反應中，作者認為HFIP聚集體可能在氫鍵介導的大環過渡態中起到類似質子梭的作用，加速脫?；倪M程（結構V所示）。綜上所述，陳弓課題組開發了利用不同取代的α-酮醛試劑，將天然多肽上兩個氨基通過咪唑結構交聯。該方法可以在溫和的條件下高效高選擇性的構建多種咪唑骨架環肽。其中，HFIP的使用是實現高反應性的關鍵，使得該反應對賴氨酸比精氨酸具有更高的化學選擇性。作者還將這些模塊化的裝訂反應用于概念驗證實驗，通過方便的兩輪篩選策略來簡化毒液肽Anoplin的溶瘤活性的構效關系研究。相關工作最近發表于Angew. Chem. Int. Ed.，通訊作者為南開大學陳弓教授。南開大學博士研究生郭盼為該論文的第一作者。https://doi.org/10.1002/anie.202318893
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