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Alkylidene環丙烷是一類天然的和合成的張力環化合物（Figure 1a），其烯烴部分可以發生轉化，且取代基之間具有不尋常的立體化學和幾何關系。單取代的聯烯與非對稱卡賓的環丙烷化可以產生八種異構體產物（Figure 1b），并且由于聯烯的特性使得它們的立體選擇性環丙烷化具有很大的挑戰。首先，由于中心缺電子的sp碳降低了聯烯的親核性，因此聯烯在環丙烷化反應中比烯烴的反應性差；其次，與末端聯烯中的端位烯烴反應在空間上是有利的，而與內部烯烴反應在電性上有利；再次，1,1-二取代非對稱聯烯中的端位烯烴的兩個面是非對映異構的，從而導致產物的不同(E)-和(Z)-構型。因此，盡管ACPs的立體化學研究已有豐富的歷史，但目前僅報道了5例ee > 90%的非手性聯烯的對映選擇性環丙化反應，且這5例是通過使用空間位阻較大的卡賓或含有第二個結合位點的金屬和過量的聯烯來克服上述挑戰的（Figure 1c）。由于很少有聯烯是商業可得的，因此對有限的聯烯實現選擇性環丙烷化反應具有重要意義。然而，通過聯烯的分子間對映選擇性環丙化形成(Z)-異構體主要產物到目前還是未知的。最近，美國加州大學伯克利分校John F. Hartwig課題組報道了一個通過定向進化的Ir(Me)-CYP119變體催化聯烯與EDA的區域選擇性環丙烷化，形成了具有優異對映選擇性的(E)-或(Z)-異構體（Figure 1d）。下載化學加APP到你手機，收獲更多商業合作機會。

（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

首先，作者以苯基聯烯和EDA作為模板底物對反應進行探索（Figure 2）。通過對酶活性位點的8個位置（V151, A152, L205, I208, A209, G213, P253, L354）進行篩選（Figure 2a），得到的最佳反應條件為：EDA (50 mM)，E . coli harboring, CYP_variant (4 uM [Ir]), M9-N緩沖液，室溫反應6小時。且當使用CYP_E?plus可以以> 99%的ee得到E-(?)-ACP異構體。此外，使用純化的CYP_E?plus酶在1 mmol的規模上制備E-(?)-ACP時，產率為69% (909 TON)，ee值為97%，且1a/1b/1c的比例為97:1:2。并且E-(?)-ACP異構體通過X-射線晶體學測定得出其為(R)-對映體（Figure 2b）。

接下來，作者還通過靶向活性位點的四個額外位點來尋找能夠形成(Z)-異構體的突變體（Figure 3）。當使用CYP_Z?minus時，可以以高達94%的ee, 28:72 E/Z得到Z式異構體產物。

（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

在確定了突變體可以對(E)-(+)、(E)-(?)和(Z)-(?)立體異構體進行選擇性識別后，作者研究了聯烯取代基對立體選擇性的影響（Figure 4）。CYP_E?plus對芳基-ACPs中芳基上的小位阻取代基如氟、甲基、甲氧基和氯具有良好的耐受性(97% ~ 99% ee)。而芳基上位阻較大的取代基如正丙基、溴和叔丁基會使ee值有小幅度的降低(分別為96% ee、92% ee和87% ee)。此外，具有更柔性的正己基和苯乙基的脂肪族ACPs也可以以良好的對映選擇性形成環丙烷。

為了評估控制立體選擇性的因素，作者進行了DFT計算和MD（molecular dynamics）模擬（Figure 5）。首先，作者對游離的、非取代的Ir(Me)-卟啉絡合物催化聯烯1的反應進行了DFT計算，揭示了輔助因子對苯基聯烯環丙烷化的內在選擇性。DFT計算表明端位雙鍵和內部雙鍵通過環丙烷化形成的E-或Z-異構體的過渡態能量均在1 kcal·mol^?1左右。最低能量過渡態（ΔG^?為4.6 kcal·mol^?1）導致(E)-ACP產物的生成，且其為主要的烯烴異構體，但由于計算所得到的ΔG^?差異很小，由此表明進化的酶的選擇性主要由與活性位點氨基酸側鏈的相互作用所控制。由于這些模型的ΔG^?值較低(4.6-5.7 kcal·mol^?1)，因此反映了Ir-卡賓中間體對聯烯的高反應活性。接下來，作者通過MD模擬表明，在CYP_{E - plus}變體中，由于Gly在213位被Leu取代，卡賓在Ir-C鍵周圍旋轉了大約100^o。此外，結合聯烯的MD模擬表明，末端烯烴以一種類似于DFT優化的(E)-(?)-ACP-TS構象接近CYP_Z?minus活性位點的卡賓。

（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）