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研究者們首先確定了經過四個月的卡路里限制的小鼠，其體內的AMPK被充分激活（圖1，下，以肌肉為例），這與AMPK在卡路里限制時起到的關鍵作用相符。然而，研究者們進一步發現在此時，小鼠卻并沒有發生“低血糖”，也就是血糖并未下降到先前他們發現的、足以激活AMPK的程度（5 mM以下）：與正常飲食的小鼠在饑餓8小時血糖就降低到4 mM（圖1，左上）相比，卡路里限制小鼠的血糖至少在5.5 mM（圖1，右上），這說明卡路里限制所導致的AMPK激活并不因為降低葡萄糖所引起。研究者們于是嘗試將卡路里限制小鼠的血清添加到細胞培養液中，的確發現即使在高糖（25 mM）的DMEM中，AMPK仍舊能被激活（圖2），這說明卡路里限制對AMPK激活的信號存在于血清中。研究者們進一步發現血清透析，去除其中的小分子代謝物，抑制了其對AMPK的激活；而熱滅活血清，去除其中的蛋白則無此作用，這說明了卡路里限制后的血清通過其中的小分子激活了AMPK。

圖1. 卡路里限制與饑餓對小鼠血糖和肌肉AMPK激活的效果對比

圖2. 卡路里限制后的小鼠血清可以激活高糖培養的細胞中的AMPK

研究者們于是進一步利用多種質譜方法（包括液相色譜-質譜，氣相色譜-質譜和毛細管電泳質譜聯用等），尋找卡路里限制后血清中發生顯著變化的小分子代謝物。發現在他們能測得的代謝物中，卡路里限制影響了超過一半的代謝物水平（695個，包括341個極性代謝物和354個脂類），這也和傳統的“飲食決定代謝”的觀點吻合。研究者于是繼續探究是哪些化合物影響了AMPK的激活。他們首先去除了血清中的脂質，發現仍能引起AMPK的激活，于是他們就把重點放在剩下的341個極性代謝物中。在這些代謝物中，有212個水平升高和129個降低：對于升高的代謝物，他們將其直接添加至細胞培養基中，觀察其是否能夠直接激活AMPK；而對于含量降低的代謝物，他們則假設這些代謝物起到了抑制AMPK的作用（在卡路里限制后，這種抑制作用就被解除）——于是將其添加到了已被卡路里限制的血清激活了AMPK的細胞的培養基中，觀察其是否能夠反過來抑制AMPK的激活。他們也設計了實驗所用的代謝物的濃度：對于已報道了生理濃度的，直接結合卡路里限制后的變化進行選擇；未報導生理濃度的，則統一選擇10 mM作為最高濃度，以此為基準進行下調，就此設定濃度梯度。經過逐個篩選，他們鑒定出了6個代謝物能夠激活AMPK，而這其中，只有石膽酸能夠在符合卡路里限制后的濃度下（血清中穩定在1 μM左右，且不隨著進食等條件發生變化；圖3，左），激活AMPK（圖3，右），而直接對小鼠，以及線蟲、果蠅等其它模式動物喂食石膽酸后，也能觀察到其體內的AMPK被激活。

圖3. 卡路里限制小鼠血清中石膽酸含量（左）以及該濃度下石膽酸對AMPK的激活（右）

研究者們于是進一步在線蟲、果蠅和小鼠中驗證石膽酸是否能模擬卡路里限制的抗衰和延壽效果。通過喂食石膽酸，他們發現線蟲和果蠅的壽命顯著增加，而且抗氧化應激能力和極端環境下的生存能力（抗逆性）也得到顯著的提升（圖4）。對于老年小鼠，發現石膽酸喂食一個月后，可以提升其抓握力和跑步能力（圖5），同時其肌肉的損傷修復能力也明顯提升，這表明石膽酸有促進小鼠肌肉的年輕化的作用。進一步地，在AMPK敲除或敲低的線蟲和果蠅（分別為aak-2的線蟲和Act5C-GAL4-AMPKα RNAi的果蠅；圖4），以及AMPK肌肉特異性敲除的老年小鼠（圖5；α-MKO）中，就觀察不到石膽酸的上述作用，這說明石膽酸是通過激活AMPK，模擬了卡路里限制的有益作用。有意思的是，作為一種次級膽酸，石膽酸是由肝臟合成的初級膽酸分泌到腸道后，由腸道微生物轉化而來；而至少目前，這樣的轉化機制在線蟲和果蠅體中還未被發現。然而即便如此，石膽酸仍能在線蟲和果蠅中激活AMPK并延壽，這說明上述動物中有一條保守的AMPK激活通路，維持了健康長壽的有益效果。

圖4.石膽酸通過AMPK延長線蟲（a）和果蠅（b）的壽命

圖5. 石膽酸通過AMPK增加老年小鼠的握力（上）和跑步能力（下）

圖6. 細胞中引入V1E1的突變對AMPK的激活效果

在此基礎上，研究者們進一步探索石膽酸是如何引起V1E1的去乙酰化的。已知體內去乙酰化酶主要是由兩大家族即SIRTs （sirtuins）家族（有SIRT1到SIRT7七個成員）和HDACs家族（HDAC1到HDAC11）組成，而在細胞中表達任意一個SIRT——尤其是SIRT1，即可以直接激活AMPK。相比較之下，HDACs家族蛋白的表達則無此現象。需要注意的是，SIRTs家族的蛋白之間有較強的redundancy，例如敲除SIRT1，其功能會被其它SIRTs所彌補，因此在細胞中敲除單個SIRT，并不能完全阻斷石膽酸對AMPK的激活。研究者們于是將7個SIRT家族蛋白全部敲除，終于檢測到了對石膽酸所引起的V1E1的去乙酰化以及對AMPK的激活的完全阻斷。作為對照，研究者們還檢測了石膽酸對另一個SIRTs（SIRT1、SIRT2和SIRT6）的經典底物——組蛋白H3的K9位點的乙酰化水平 (12-14)，結果也表明，石膽酸促進了H3-K9的去乙酰化。因此，石膽酸是通過促進SIRTs的活力，使其去乙酰化V1E1并抑制v-ATPase的活力，從而啟動溶酶體途徑并激活AMPK。

然而，當研究者們試圖進一步在體外重構上述石膽酸促進SIRTs活力的過程時，卻遇到了困難：他們發現，盡管原核表達的SIRT1的確能夠在體外去乙酰化合成的V1E1多肽，但石膽酸卻不能促進這一過程（圖7，左）。這和體內得到的結論完全不同，也讓研究者們陷入了困境——難道是上述的篩選過程出錯了嗎？于是，他們把體外系統中的每種成分一步步地“替換”成近似于細胞內的成分，最終發現，當使用從細胞中純化（免疫沉淀）所得到的SIRT1代替原核表達的SIRT1，或者讓原核表達的SIRT1先和細胞裂解液孵育，再加進體外系統中，就能夠觀察到石膽酸對SIRT1活力的提升了（圖7，右）！這意味著SIRT1在體內天然存在著一個“伙伴”：由它來結合石膽酸，再反過來導致SIRT1的激活；而原核表達的SIRT1沒有這個“伙伴”的結合，自然也就不能響應石膽酸的調節。

圖7. 石膽酸對原核表達SIRT1蛋白（左）以及與細胞裂解液孵育后的、原核表達的SIRT1蛋白（右）的去乙酰化活力影響

圖8. TULP3敲除阻止了石膽酸對AMPK的激活（左），且回補不結合石膽酸的突變體（TULP3-4G）無法恢復石膽酸對AMPK的激活（右）

圖9. 石膽酸對老年小鼠抓握力（上）和跑步能力（下）的提高依賴于TULP3

綜上，林圣彩院士團隊鑒定了一個卡路里限制的模擬物——石膽酸，并解析了石膽酸通過TULP3-sirtuin-v-ATPase-AMPK軸發揮延壽效果的具體機制（圖9，右），這一發現補全了機體感知卡路里限制引起的代謝信號并發揮延緩衰老作用的空白。石膽酸是否可以作為新的長壽藥物將進行進一步臨床驗證。同時，對于石膽酸延壽機理的解析也為開發新的長壽藥物提供了新的理論和靶點。

回顧起來，林圣彩院士感嘆，他的團隊從發現（低）葡萄糖感知通路是延長壽命的核心軸 (8-10, 15)，到發現該通路除了能感知餐前正常的葡萄糖下降，也介導了二甲雙胍的有益功能（圖10，左），再到現在加上了卡路里限制的模擬物也就是石膽酸的“借道”（圖10，右），他越發覺得AMPK的溶酶體通路是高等生物中的固有的通路，也很可能因為這樣重要的生理功能，而在進化上被保留下來。可以說，這是大自然賜予生命的不僅能抵抗饑餓，還能從饑餓中獲得益處的“賦能”。

圖10. 溶酶體通路全景圖

這兩篇文章的第一研究者瞿琦是廈門大學2014級本科生，于2018年留校攻讀碩士，并在2019年轉博至今。據林圣彩院士介紹，瞿琦是在2016年，通過廈門大學“大學生創新訓練計劃”進入他的實驗室學習的，從那時起，他就參與了這個工作，為石膽酸及其靶點和機制的鑒定付出了八年半的辛勤努力；尤其是在發現石膽酸并不能直接促進SIRT1的活力，還需要重新尋找其靶點的時候，他沒有氣餒，而是心無旁騖地又付出了三年半的時間，最終完成了整個機制的發現，也深深地鼓舞了團隊的所有人。兩篇文章的共同第一研究者陳艷和王鈺則分別鑒定出了石膽酸及其通路在果蠅、小鼠和線蟲中的功能，而第二篇文章的共同第一研究者王維澈則承擔了SIRTs的相互作用蛋白的篩選和鑒定，他們和林圣彩院士團隊的其它成員一起，都為該工作的研究做出了不可替代的貢獻。

此外，大連化物所樸海龍研究員和遺傳與發育所稅光厚教授指導了本文的代謝物鑒定，北京大學姜長濤教授和廈門大學郭浩教授指導、分析了腸道菌群對石膽酸的產生影響，廈門大學俞勇教授、北京大學劉穎教授和廈門大學劉波教授、鄭燚明教授分別指導了線蟲和果蠅的相關實驗，廈門大學鄧賢明教授指導了石膽酸制劑的制作與使用，廈門大學田華雨教授和陳穎教授指導、協助了多個敲入細胞系的構建，廈門大學分析測試中心的多位技術人員承擔了本研究的代謝物和蛋白質譜鑒定工作，廈門大學實驗動物中心則提供、構建了本研究所用到的小鼠品系。